صفحه اصلیگزارش آماریکتابخانه های مرکزیراهنماورود
رکورد قبلیرکورد بعدی
سرشناسه : ‏‏خالق نژاد، سعیده‏ ، پديدآور
عنوان اصلی : کلونینگ آنزیم پیرازینامیداز جهش یافته جدا شده از نمونه¬های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مقاوم به پیرازینامید به منظور بررسی تغییرات عملکردی آن
پژوهشگر : / خالق نژاد، سعیده
استاد راهنما : فرحنوش دوستدار
استاد مشاور : مریم واعظ جلالی، محمدجواد نصیری
محل تحصیل : : دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی – درمانی شهید بهشتی دانشکده پزشکی
سال تحصیل : ، ۱۳۹۸-۹۹
مقطع تحصیلی : کارشناسی ارشد
رشته تحصیلی : میکروب شناسی
چکيده : چکیده فارسیعنوان: کلونینگ آنزیم ¬های پیرازینامیداز جهش یافته جدا شده از نمونه¬های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مقاوم به پیرازینامید به منظور بررسی تغییرات عملکردی آنمشخصات استاد راهنما: دکتر فرحنوش دوستدار f_doustdar@yahoo.comمحل كار: دانشكده پزشكي شهید بهشتی، تلفن: 23872556شغل و سمت فعلي استاد راهنما: عضو هيئت علمي، دانشیار گروه میکروب شناسی دانشکده پزشکی شهید بهشتی سازمان متبوع: دانشگاه علوم پزشكي شهید بهشتیمشخصات اساتید مشاور:استاد مشاور اول: دکترمریم واعظ جلالی maryam.Vaezjalali@gmail.comمحل كار: دانشكده پزشكي شهید بهشتی، تلفن: 23872556شغل و سمت فعلي استاد مشاور: عضو هيئت علمي، دانشیار گروه میکروب شناسی دانشکده پزشکی شهید بهشتیسازمان متبوع: دانشگاه علوم پزشكي شهید بهشتی استاد مشاور دوم:دکتر محمدجواد نصیریmj.nasiri@hotmail.com شغل و سمت فعلي استاد مشاور: عضو هيئت علمي، استادیار گروه میکروب شناسی دانشکده پزشکی شهید بهشتیسازمان متبوع: دانشگاه علوم پزشكي شهید بهشتی تلفن: 23872556مشخصات دانشجو MSc :سعیده خالق نژاد saeedeh.khaleghnezhad@gmail.comمحل تحصیل: دانشكده پزشكي شهید بهشتی، گروه میکروب شناسی، شماره تلفن: 09381155093متن چکیده فارسیعنوان: کلونینگ آنزیم¬های پیرازینامیداز جهش یافته جدا شده ازنمونههای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس مقاوم به پیرازینامید به منظور بررسی تغییرات عملکردی آنسابقه و هدف: پيرازيناميد همراه با ايزونيازيد و ريفامپين براي درمان سل مقاوم به دارو مورد استفاده قرار مي گيرد. پيرازيناميد يک پيش دارو است که توسط آنزيم پيرازيناميداز به پيرازينوئيک اسيد که فرم فعال دارو مي باشد، تبديل مي شود. پيرازيناميد به دليل فعال بودن برعليه باکتريهايي که درون محيط اسيدي ماکروفاژ بقا دارند جز مهمي از درمان کوتاه مدت سل محسوب مي شود. تحقيقات مختلف مشخص کرده اند که مقاومت به پيرازيناميد در مايکوباکتريوم توبرکلوزيس عمدتا ناشي از موتاسيون در ژن pncA مي باشد. جالب توجه است که اين موتاسيونها در نقاط جغرافيايي مختلف بسيار متنوع مي باشند که نياز براي مطالعات بيشتر در مورد اين موتاسيونها را در هر منطقه نشان میدهد. از آنجاییکه اطلاعات در مورد عملکرد و ساختار پيرازيناميدهاي موتانت مرتبط با مقاومت به پيرازيناميد محدود است، بنابراين در اين تحقيق هدف اينست که با مطالعات تجربي و محاسباتي جنبه هاي مختلف عملکرد آنزيم پيرازيناميداز موتانت را مشخص کنيم. اين اطلاعات مي تواند براي طراحي و پيشنهاد داروي مناسب براي درمان بيماران مقاوم به پيرازيناميد مورد استفاده قرار گيرد.روش بررسی:در اين مطالعه ژن pncA کد کننده پیرازینامیداز موتانت از باکتری مقاوم به پیرازینامید جدا شده و مراحل کلون، بيان و خالص سازي پروتئین انجام گرفت. سپس این پروتئین به روش SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ تایید شد. اثر موتاسيون¬ها با استفاده از روشهای بیوشیمیایی بصورت تجربي مطالعه شد. فعالیت آنزیم با استفاده از فاکتورهاي کينتيک و مقاومت حرارتي وpH با استفاده از روش اسپکتروسکوپی در مقايسه با آنزيم وحشي مورد بررسي قرار گرفت.یافته‌ها: در این مطالعه پروتئین پیرازینامیداز موتانت بیان و تخلیص شد و با تکنیک های مورد نظر تایید گردید. ميزان بيان بهينه در 500 ميلي ليتر محيط كشت،1ميلي گرم در ميلي ليتر پروتئين تخليص شده بود كه توسط روش برادفورد تعيين غلظت شد. پیرازینامیداز دارای موتاسیون نسبت به پیرازینامیداز وحشی فعالیت پایین تری را در مطالعات کنتیکی نشان داد. در تست پیرازینامیداز موتانت فعالیت خود را از 5pH= شروع کرد و در 5/8pH= بیشترین فعالیت را نشان داد و سپس از 9pH= فعالیت آن افت کرد ولی پیرازینامیداز وحشی فعالیت خود را از 3pH= شروع کرده و در 5/7pH= بیشترین فعالیت را نشان داد که بهترین pH برای فعالیت طبیعی آنزیم در آزمایشگاه و تبدیل فرم پیرازینامید به پیرازینوئیک اسید است و سپس از 8pH= فعالیت آن افت کرد. پیرازینامیداز موتانت در غلظت 20 میلی مولار از سوبسترا دارای بیشترین سرعت واکنش(Vmax) بود و در غلظت های بیشتر از سوبسترا (پيرازيناميد ) سرعت واکنش ثابت ماند. برای تعيين ميزان تمايل آنزيم موتانت به سوبسترا ، Km آنزيم (ثابت ميکائيليس) با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism ،01/1 ميلي مولار بدست آمد. بحث و نتیجه گیری: در تحقیق حاضر، پلاسميد PET-21a+ با موفقیت برای انتقال ژن pncA موتاسیون یافته كدكننده¬ی آنزيم پیرازینامیداز باكتری مايکوباكتريوم توبركلوزيس، به سويه بياني BL21 از باكتری E.coli مورد استفاده قرار گرفت. بيان در حجم بالا در 37 درجه به مدت 4 ساعت با غلظت باکتریایی با جذب نوری 9/0 انجام گرفت که نشان دهنده این است که موتاسیون مورد بررسی موجب عدم بیان آنزیم نگردیده است.در تحقیق حاضر میزان Km آنزيم پیرازینامیداز موتانت کلون شده ،01/1 ميلي مولار بود که نشان دهنده آن است که موتاسیون مورد بررسی در میزان اتصال آنزیم به سوبسترا تاثیری نداشته است.در این تحقیق بالاترین فعالیت آنزیم پیرازینامیداز جهش یافته در 8 =pH مشاهده شد. با توجه به شرایط اسیدی عملکرد دارو در داخل ماکروفاژها و اهمیت عملکرد آنزیم در PH های پایین، می¬توان نتیجه گرفت که موتاسیون مورد بررسی موجب کاهش عملکرد آنزیم در PH اسیدی داخل ماکروفاژ و در نتیجه مقاومت به دارو می گردد. استفاده از اوره برای تخلیص پروتئین پیرازینامیداز موجب کاهش فعالیت آنزیم گردید که می تواند بواسطه دناتوره شدن آنزیم توسط اوره و تغییر در جایگاه فعال آنزیم باشد.واژگان کلیدی:مايکوباکتريوم توبرکلوزيس، مقاومت دارويي، پيرازيناميد، جهش
: AbstractCloning of mutated pyrazinamidase enzyme of pyrazinamide resistant Mycobacterium tuberculosis for analysis of its functional changesIntroduction: Pyrazinamide along with isoniazid and rifampin are used to treat drug-resistant TB. Pyrazinamide is a predrug which is converted to pyrazinoic acid, an active form of the drug by the Mycobacterium tuberculosis pyrazinamidase enzyme. Pyrazinamide is an important component of short-term treatment of tuberculosis because it is active against bacteria that survive inside macrophage acidic medium. Various studies have shown that resistance to pyrazinamide in Mycobacterium tuberculosis is mainly due to mutation in the pncA gene. Interestingly, these mutations are very diverse in different geographical locations, indicating the need for further studies on these mutations in each region. Various studies have shown that resistance to pyrazinamide in Mycobacterium tuberculosis is mainly due to mutation in the pncA gene. Interestingly, these mutations are very diverse in different geographical regions, indicating the need for further studies on these mutations in each region. Since information on the function and structure of pyrazinamidase mutants related to pyrazinamide resistance is limited, the aim of this study was to determine the different aspects of mutant pyrazinamidase enzyme function through experimental and computational studies. This information can be used to design and propose an appropriate drug for the treatment of patients with pyrazineamide resistance.Method: In this study, the pncA gene encoding the mutant pyrazinamidase was isolated from pyrazinamide resistant bacteria and cloning, expression and protein purification steps were performed. The protein was then confirmed by SDS-page and Western blotting techniques. The effect of mutations was studied experimentally using biochemical methods. The enzyme activity was evaluated by kinetic factors, heat resistance and pH in comparison with wild type enzyme.Results: In this study, the mutated pyrazinamidase protein was expressed and purified and confirmed by the desired techniques. The optimum expression level in 500 ml of culture medium was 1 mg / ml of purified protein which was determined by Bradford method. The mutant pyrazinamidase showed lower activity in the kinetic studies comparing the wild pyrazinamidase. The mutant pyrazinamidase enzyme started its activity at pH = 5 and reached its peak activity at pH = 8.8 and its activity decreased at pH = 9, but the wild pyrazineamidase started its activity at pH = 3 and reached its Maximum activity at pH = 7.5 which have been shown to be the best pH for normal enzyme activity in the laboratory and conversion of pyrazinamide to pyrazinoic acid and then its activity decreased by pH = 8. The mutant pyrazinamidase had the highest reaction rate (Vmax) at the concentration of 20 mM of substrate and the reaction rate remained constant at higher concentrations of the substrate (pyrazinamide). To determine the amount of mutant enzyme affinity to the substrate, the Km (Michaelis constant) of the enzyme was obtained 1.01 mM using GraphPad Prism software.Discussion and Conclusion: In the present study, the plasmid PET-21a + was successfully used to transfer the pncA gene encoding the pyrazinamidase enzyme of mycobacterium tuberculosis to the expression strain BL21 of E. coli. High volume expression was performed at 37 ° C for 4 h with bacterial concentration of 0.9, indicating that the investigated mutation did not stop the expression of Pyrazinamidase Enzyme. In the present study, the Km of the cloned mutant pyrazineamidase was 0.01 mM, indicating that the investigated mutation did not affect the mount of enzyme binding to the substrate. In this study the highest mutated enzyme activity was observed at pH = 8, which can justify the decrease in enzyme function inside the acidic medium of macrophages of the human body. Using urea for purification of Pyrazinamidase protein decreases its activity which may be due to denaturation of the enzyme and changes in its active site. Key words: Mycobacterium tuberculosis, Drug resistance, Pyrazinamide, Mutation.
کلیدواژه : مايکوباکتريوم توبرکلوزيس، مقاومت دارويي، پيرازيناميد، جهش

ارسال پیغام

آمار سامانه

تعداد دانشگاه ها :63
تعداد پایان نامه ها:306883
آخرین بروزرسانی:۱۳۹۸/۱۰/۱۰
کاربران آنلاین:145
بازدید امروز:2690
بازدید کل:2621354

تماس با ما

شهرک قدس، بلوار فرحزادی، بلوار ایوانک، ساختمان مرکزی وزارت بهداشت، درمان وآموزش پزشکی، بلوک A، طبقه ۱۳، معاونت تحقیقات و فناوری ، مرکز توسعه وهماهنگی اطلاعات وانتشارات علمی، گروه اطلاع رسانی پزشکی

تلفن تماس: 81454318-021

توجه

کلیه حقوق این وب سایت و مطالب آن متعلق به مرکز توسعه و هماهنگی اطلاعات و انتشارات علمی معاونت تحقیقات و فناوری وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی بوده و هر استفاده از مطالب آن با ذکر منبع بلامانع است

DEVELOPED BY PARSAZARAKHSH
COPYRIGHT BY THESIS.RESEARCH.AC.IR ALL RIGHT RESERVED, IRAN, TEHRAN